La diagnosi certa della mononucleosi avviene esclusivamente attraverso una visita medica di controllo in cui viene verificato che alcuni organi non risultino ingrossati, ovvero principalmente i linfonodi, le tonsille e il fegato. Nel caso si sospetti la malattia, tra i principali esami mononucleosi si trova un semplice test ematico in cui viene dosato l'indice di infezione, così come la cosiddetta "transaminasi" (enzimi la cui alta concentrazione indica problematiche al fegato) e la "bilirubina" (un pigmento presente nella bile e nel sangue). Va poi eseguito un esame che vada a riguardare gli anticorpi del virus che origina la mononucleosi (Epstein Barr) valutando i dosaggi delle IgM e delle IgG. Le prime segnalano la presenza di un'attuale infezione mentre le seconde informano dell'eventuale contagio avvenuto in passato.
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Per la ricerca degli anticorpi di tipo eterofilo caratteristici della mononucleosi di tipo infettivo esistono due particolari tipologie di esami. Il primo è il cosiddetto "MNI-Test", altrimenti noto come "reazione su lama". Si tratta di un esame dall'esecuzione rapidissima che permette di verificare, evidenziandola, la presenza all'interno del sangue degli anticorpi anti-Epstein-Barr. È un test che viene utilizzato prevalentemente se i sintomi della mononucleosi infettiva non sono particolarmente netti ma limitati a febbre, stato di affaticamento e faringite. Il secondo test, la cosiddetta "Reazione di Paul Bunnel Davidsohn" permette anch'esso di evidenziare la presenza di questi anticorpi. Contrariamente, però, al precedente (in cui si possono verificare dei risultati falsi positivi), questo ha caratteri più specifici e viene utilizzato per confermare l'eventuale positività del MNI-Test.
Il primo test previsto, invece, in caso di sospetta mononucleosi è la cosiddetta Immunofluorescenza indiretta. Questo permette di evidenziare sia gli anticorpi di tipo VCA che quelli di tipo ANTI-EA. Tra gli esami mononucleosi che garantiscono sicuramente risultati più previsi e certi, vi è la cosiddetta Sierologia Anti EBV che permette l'identificazione certa dell'infezione dosando diverse tipologie di anticorpi come l'IgG-VCA o l'IgG-EA. È possibile, in base ai valori ottenuti, identificare vari tipi di mononucleosi. Negli esami che si effettuano per evidenziare l'eventuale presenza della patologia, il prelievo del campione da analizzare può avvenire secondo diverse metodologie. La più utilizzata risulta essere il semplice prelievo di sangue venoso, preferibilmente in condizione di digiuno.
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